1. Если я получу пробирку с замороженными клетками, могу ли я сразу поместить ее в жидкий азот для хранения?
Во многих случаях клетки, транспортируемые на сухом льду (-80°C), можно снова поместить в жидкий азот, а затем быстро оттаять.Однако жизнеспособность клеток может быть снижена после такой обработки.Для некоторых чувствительных клеточных линий это может затруднить восстановление клеток.Считается, что это явление связано с изменением структуры кристаллов льда внутри клеток в результате изменения температуры.Поэтому рекомендуется размораживать и культивировать клетки как можно скорее после получения.Сокращение времени хранения при -80°C.Эта температура используется только для транспортировки.
2. Какие меры безопасности следует соблюдать при извлечении клеток из жидкого азота для восстановления?
Криопробирки с жидким азотом, которые не полностью герметизированы и в них просачивается жидкий азот, могут вызвать взрыв, если температура криопробирки резко возрастет при оттаивании.Поэтому рекомендуется носить очки и защитные перчатки при извлечении клеток из жидкого азота.Для реанимации пробирку для замораживания следует непрерывно встряхивать на водяной бане при температуре 37°C, чтобы полностью оттаять замораживающий раствор в течение 1-2 минут.Затем протрите пробирку снаружи спиртовой салфеткой, затем отнесите ее в ультрачистый стол и перенесите клетки в центрифужную пробирку с добавлением 10 мл питательной среды, центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 5-10 минут, выбросьте надосадочной жидкости, добавьте соответствующее количество культуральной среды, инокулируйте культуральную колбу и инкубируйте в инкубаторе с 5% CO2.
3. Почему клетки следует хранить в паровой фазе резервуара с жидким азотом, а не в жидкой фазе?
Клетки, хранящиеся в газовой фазе жидкого азота, с большей вероятностью оживляются.Принимая во внимание, что в жидкой фазе жидкого азота, если пробирки для лиофилизации не закрыты должным образом или имеют утечки, прямой контакт между клетками и жидким азотом может поставить под угрозу жизнеспособность клеток после оттаивания.
4. Как изменить культуральную среду для суспензионных клеток?
Культивирование суспензионных клеток можно проводить, просто добавляя свежую среду (если позволяет место) или отделяя клетки от старой среды центрифугированием (100 x g в течение 5 минут) и впоследствии ресуспендируя осажденные клетки в свежей среде.Однако для большинства суспензионных клеточных линий лучшим методом является простое добавление среды.В любом случае, среда должна быть обновлена до того, как клетки достигнут наибольшей плотности насыщения.Плотность насыщения клеток колеблется от 3 х 10 5 до 2 х 10 6 в зависимости от клеточной линии и условий культивирования (покой или перемешивание, уровни оксигенации и т. д.).Клетки должны быть разбавлены до более низкой концентрации клеток, чтобы обеспечить достаточное восстановление питательных веществ для сохранения логарифмического роста клеток.Если просто заменить среду без снижения плотности клеток, клетки быстро истощат среду и погибнут.Если клетки разбавлены ниже их наименьшей плотности, они войдут в лаг-фазу и будут расти очень медленно или умрут.Каждая суспензионная клеточная линия имеет различную плотность насыщения и интервал пассирования, поэтому ежедневный подсчет клеток — это способ мониторинга суспензионных клеточных линий*.
5. Каков рекомендуемый уровень CO2 для клеточной культуры?
Хотя уровни CO2 в системах культивирования клеток колеблются от 0,03% до 40% (обычно около 0,03% CO2 в атмосфере), очень часто CO2 не добавляют в воздух или концентрация CO2 составляет от 5% до 10%.Важно отрегулировать концентрацию бикарбоната натрия в среде, чтобы сбалансировать уровень CO2 в газовой фазе.Клетки производят CO2 и требуют небольшого количества угольной кислоты для роста и выживания.Если CO2 не добавляется и клетки размножаются, можно использовать 4 мМ (0,34 г/л) безводного бикарбоната натрия.Однако в этот момент крышка культурального флакона должна быть затянута.Если для культуральной системы требуется 5% или 10% CO2, используйте 23,5 мМ (1,97 г/л) или 47 мМ (3,95 г/л) бикарбоната натрия при 37°C соответственно с начальным pH примерно 7,6.В этих условиях колбу следует оставить открытой или использовать чашку Петри для поддержания газового равновесия.
6. Зачем некоторым клеткам нужен пируват натрия?Сколько пирувата натрия следует добавить в среду?
Пируват является метаболитом органической кислоты в гликолитическом пути*, который легко проникает в клетку и покидает ее.Следовательно, добавление пирувата натрия в среду обеспечивает как источник энергии, так и источник углерода для анаболизма, помогает поддерживать определенные специфические клетки, помогает при клонировании клеток или необходимо при снижении концентрации сыворотки в среде.Пируват натрия также помогает снизить цитотоксичность, вызванную флуоресценцией.Пируват натрия обычно добавляют в конечной концентрации 1 мМ.коммерчески доступные растворы пирувата натрия обычно представляют собой раствор для хранения 100 мМ (100X).
Переведено с www.DeepL.com/Translator (бесплатная версия).
Время публикации: 21 июня 2022 г.