Количественная флуоресцентная ПЦР в реальном времени представляет собой метод измерения общего количества продукта после каждого цикла полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реакции амплификации ДНК с использованием флуорофора.Этот метод используется для количественного определения определенных последовательностей ДНК в образце, подлежащем тестированию, с помощью внутренних или внешних эталонных методов.С момента своего появления флуоресцентные количественные ПЦР становятся все более популярными среди преподавателей лабораторий.
Принцип флуоресцентной ПЦР: Флуоресцентная ПЦР, сначала названная TaqManPCR, а затем также ПЦР в реальном времени, представляет собой новый метод количественного определения нуклеиновых кислот, разработанный компанией PE (PerkinElmer) в США в 1995 г. Этот метод основан на добавлении флуоресцентно меченного зонда или соответствующего флуоресцентный краситель для обычной ПЦР для достижения его количественной функции.Принцип: по мере протекания реакции ПЦР продукты реакции ПЦР накапливаются и интенсивность флуоресцентного сигнала увеличивается в равной пропорции.С каждым циклом собирается сигнал интенсивности флуоресценции, чтобы мы могли отслеживать изменение количества продукта по изменению интенсивности флуоресценции и, таким образом, получать график кривой усиления флуоресценции.
В целом, кривую усиления флуоресценции можно разделить на три фазы: фазу фонового сигнала флуоресценции, фазу экспоненциального усиления сигнала флуоресценции и фазу плато.Во время фазы фонового сигнала усиленный сигнал флуоресценции маскируется фоновым сигналом флуоресценции, и изменения количества продукта определить невозможно.В фазе плато продукт амплификации больше не увеличивается экспоненциально, нет линейной зависимости между количеством конечного продукта и количеством исходной матрицы, и исходное количество копий ДНК нельзя рассчитать на основе количества конечного продукта ПЦР.Только в фазе экспоненциального усиления флуоресцентного сигнала существует линейная зависимость между логарифмом количества продукта ПЦР и исходным количеством шаблона, и мы можем выбрать количественную оценку этого на данном этапе.Для удобства количественного определения и сравнения в технику количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени введены два очень важных понятия: порог флуоресценции и значение CT.
Порог представляет собой искусственно установленное значение на кривой усиления флуоресценции.экспоненциальная фаза амплификации ПЦР.
Значение Ct: это количество циклов, которое сигнал флуоресценции в каждой реакционной пробирке претерпел для достижения заданного значения домена.
Взаимосвязь между значением Ct и начальным шаблоном: исследования показали, что значение Ct каждого шаблона имеет линейную зависимость от логарифма начального числа копий этого шаблона, чем больше копий начального числа копий, тем меньше Ct ценность.Значения Ct относительно стабильны.Стандартную кривую можно построить, используя стандарт с известным начальным номером копии, где горизонтальная координата представляет собой логарифм начального числа копий, а вертикальная координата представляет собой значение Ct, как показано на рисунке ниже.
Следовательно, получив значение Ct неизвестного образца, начальное количество копий этого образца можно рассчитать по стандартной кривой.
Значение Ct непостоянно и может зависеть от разных образцов и разных инструментов, даже если один и тот же образец повторяется 2 раза на одном и том же инструменте, значение Ct может варьироваться.
Количественные анализы флуоресценции: Количественные анализы флуоресценции можно разделить на флуоресцентные зонды и флуоресцентные красители в зависимости от используемых маркеров.Флуоресцентные зонды включают технологию Beacon (технология молекулярного маяка, представленная American Tagyi), зонды TaqMan (представленная ABI) и технологию FRET (представленная Roche);флуоресцентные красители включают насыщенные флуоресцентные красители и ненасыщенные флуоресцентные красители, типичным представителем ненасыщенных флуоресцентных красителей является широко используемый в настоящее время SYBRGreen I;насыщенные Типичным представителем ненасыщенных флуоресцентных красителей является SYBRGreenⅠ;насыщенные флуоресцентные красители – EvaGreen, LCGreen и др.
SYBRGreenI — широко используемый ДНК-связывающий краситель для флуоресцентной ПЦР, который неспецифически связывается с двухцепочечной ДНК.В свободном состоянии SYBRGreenI излучает слабую флуоресценцию, но после связывания с двухцепочечной ДНК его флуоресценция увеличивается в 1000 раз.Следовательно, общий сигнал флуоресценции, испускаемый реакцией, пропорционален количеству присутствующей двухцепочечной ДНК и увеличивается по мере увеличения продукта амплификации.
Преимущества двухцепочечных ДНК-связывающих красителей: простой экспериментальный дизайн, требуется только 2 праймера, нет необходимости в разработке зондов, нет необходимости в разработке нескольких зондов для быстрого тестирования нескольких генов, возможность проводить анализ кривой температуры плавления, тестировать специфичность реакция амплификации, низкая начальная стоимость, хорошая универсальность и, следовательно, чаще используется в исследованиях в стране и за рубежом.
Метод флуоресцентного зонда (метод Такмана): при проведении ПЦР-амплификации добавляется пара праймеров вместе со специфическим флуоресцентным зондом.Когда зонд не поврежден, сигнал флуоресценции, испускаемый репортерной группой, поглощается погашенной группой и не обнаруживается прибором ПЦР;во время амплификации ПЦР (в фазе удлинения) 5'-3'-расщепляющая активность фермента Taq ферментативно разрушает зонд, создавая репортерную флуоресцентную группу и тушенную флуоресцентную группу
Применение флуоресцентной количественной ПЦР.
Молекулярно-биологические исследования:
1. Количественный анализ нуклеиновых кислот.Количественный и качественный анализ инфекционных заболеваний, обнаружение патогенных микроорганизмов или вирусов, таких как недавняя эпидемия гриппа A (H1N1), определение числа копий генов трансгенных растений и животных, определение показателей инактивации генов РНКи и т. д.
2. Дифференциальный анализ экспрессии генов.Сравнение различий в экспрессии генов между обработанными образцами (например, лекарственная обработка, физическая обработка, химическая обработка и т. д.), различий в экспрессии конкретных генов на разных фазах и подтверждение результатов микрочипа кДНК или результатов дифференциальной экспрессии
3. Обнаружение SNP.Обнаружение полиморфизма одиночных нуклеотидов важно для изучения индивидуальной восприимчивости к различным заболеваниям или индивидуальной реакции на определенные лекарства, а из-за хитроумной структуры молекулярных маяков, как только известна информация о последовательности SNP, легко и точно определить используйте этот метод для высокопроизводительного обнаружения SNP.
4. Обнаружение метилирования.Метилирование связано со многими заболеваниями человека, особенно с раком, и Лэрд сообщил о методе под названием Methyllight, который обрабатывает ДНК до амплификации, так что неметилированный цитозин становится урацилом, а метилированный цитозин не подвергается воздействию, с использованием специфических праймеров и зондов Taqman для различения метилированной и неметилированной ДНК. .более чувствителен.
Медицинские исследования:
1. Пренатальная диагностика: люди не могут лечить наследственные заболевания, вызванные измененным генетическим материалом, и пока что они могут только уменьшить количество рождающихся больных детей с помощью пренатального наблюдения для предотвращения возникновения различных наследственных заболеваний.Это неинвазивный метод, который легко переносится беременными женщинами.
2. Обнаружение возбудителя. Флуоресцентный количественный ПЦР-анализ позволяет количественно определять такие возбудители, как гонококки, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, вирус папилломы человека, вирус простого герпеса, вирус иммунодефицита человека, вирус гепатита, вирус гриппа, Mycobacterium tuberculosis, EBV и цитомегаловирус.Он имеет преимущества высокой чувствительности, небольшого размера выборки, быстроты и простоты по сравнению с традиционными методами тестирования.
3. Оценка эффективности лекарств: количественный анализ вируса гепатита В (ВГВ) и вируса гепатита С (ВГС) показывает, что существует взаимосвязь между вирусной нагрузкой и эффективностью некоторых лекарств.Если уровень сывороточной ДНК HBV снижается во время лечения ламивудином, а затем снова повышается или превышает предыдущий уровень, это свидетельствует о мутации вируса.
4. Онкогенетическое тестирование. Хотя механизм развития опухоли еще не ясен, общепризнано, что мутации в соответствующих генах являются основной причиной онкогенной трансформации.Повышенную экспрессию и мутацию онкогенов можно наблюдать на ранних стадиях многих опухолей.Количественная флуоресцентная ПЦР в реальном времени не только эффективна для обнаружения мутаций в генах, но также может точно определять экспрессию онкогенов.Этот метод использовался для обнаружения экспрессии различных генов, включая ген теломеразы hTERT, ген хронического гранулоцитарного лейкоза WT1, онкогенный ген ER, ген PSM рака предстательной железы и вирусные гены, ассоциированные с опухолью.
Переведено с www.DeepL.com/Translator (бесплатная версия)
Время публикации: 21 июня 2022 г.